Bakteryjna „nanostrzykawka” może dostarczać terapię genową do ludzkich komórek

Bakteryjna nanostrzykawka (na zielono) wiąże się z komórkami owadów (na niebiesko) przed wstrzyknięciem białek ładunku. Źródło: Joseph Kreitz/Broad Institute of MIT and Harvard/MIT McGovern Institute for Brain Research

Wewnątrz jelita gąsienicy żyje robak, a wewnątrz robaka czai się bioluminescencyjna bakteria o nazwie Photorhabdus asymbiotica, która sprawia, że gąsienica świeci w ciemności. Ale ta przypominająca matrioszkę konfiguracja ma inny, bardziej szkodliwy efekt: bakterie wydzielają śmiercionośną strzykawkę molekularną o długości 100 nanometrów, która przyczepia się do komórek owada. Po przyczepieniu się do komórki, strzykawka przebija molekularną włócznią błonę komórkową, po czym uwalnia toksyczny ładunek. Gdy owad-gospodarz umiera i rozkłada się, bakterie uciekają, by skolonizować następną ofiarę.

W artykule opublikowanym w „Nature” naukowcy donoszą o przeprojektowaniu strzykawki Photorhabdus, zwanej kurczliwym systemem wtryskowym, tak, aby mogła przyczepiać się do ludzkich komórek i wstrzykiwać do nich duże białka. Praca ta może zapewnić sposób na dostarczane różnych białek terapeutycznych do dowolnego rodzaju komórek, w tym białek, które mogą „edytować” DNA komórki. „To bardzo interesujące podejście” - mówi Mark Kay, badacz terapii genowych na Uniwersytecie Stanforda, który nie był zaangażowany w badanie. „Myślę, że może być bardzo przydatne, gdy chcesz doprowadzić do ekspresji białek, które mogą edytować genom”, aby skorygować lub wyeliminować gen, który został zmutowany w przebiegu choroby genetycznej.

Nano wstrzykiwacz może stanowić kluczowe narzędzie dla naukowców zainteresowanych modyfikowaniem genów. „Dostarczanie jest prawdopodobnie największym nierozwiązanym problemem związanym z edycją genów” - mówi badacz Feng Zhang, biolog molekularny z McGovern Institute for Brain Research w Massachusetts Institute of Technology oraz Broad Institute of M.I.T. and Harvard. Zhang jest znany ze swojej pracy nad rozwojem systemu edycji genów CRISPR-Cas9. Istniejąca technologia może wprowadzić maszynę do edycji „kilku tkanek, krwi, wątroby i oka, ale nie mamy dobrego sposobu, aby dostać się gdziekolwiek indziej”, do tkanek tworzących organy takie jak mózg, serce, płuca lub nerki, mówi Zhang. Technologia strzykawek jest również obiecująca w leczeniu raka, ponieważ można ją zaprojektować tak, aby łączyła się z receptorami na niektórych komórkach nowotworowych.

Zhang szukał nowych sposobów dostarczania enzymów edytujących geny do komórek, gdy dwa lata temu on i jego doktorant Joseph Kreitz przeczytali dwa artykuły na temat systemu iniekcji Photorhabdus. System ten był wyjątkowy, ponieważ został dostosowany do komórek owadów. „To jeden z bardzo rzadkich sytuacji, w których bakteria wstrzykuje się do komórki zwierzęcej”, a nie do innej komórki bakteryjnej, mówi Zhang. „Pomyśleliśmy, że skoro można coś wstrzyknąć do komórki zwierzęcej, to może zadziała też na komórkach ludzkich”.

Naukowcy masowo wyprodukowali miniaturowe wstrzykiwacze, wprowadzając plany genetyczne wtryskiwaczy do bakterii Escherichia coli. Bakterie E. coli sumiennie produkowały maleńkie strzykawki, które po kontakcie z komórkami owadów wiązały się z nimi i wstrzykiwały toksyny zgodnie z oczekiwaniami. Ale kiedy Kreitz i Zhang przetestowali te wtryskiwacze na ludzkich komórkach, nie zadziałały. „Musieliśmy więc zastanowić się: Jak to zaprojektować?” mówi Zhang.

Zespół Zhanga skupił się na mackowatych strukturach wtryskiwaczy zwanych włóknami ogonowymi, które chwytają i przytrzymują komórki, zanim wtryskiwacz przebije błonę komórkową. Naukowcy zmodyfikowali te włókna na ponad 100 różnych sposobów, próbując zmusić je do przyczepienia się do ludzkich komórek. Nic nie działało. Następnie, około roku po rozpoczęciu projektu, z pomocą przyszła im nowo wydana wersja oprogramowania sztucznej inteligencji o nazwie AlphaFold. AlphaFold przewiduje trójwymiarową strukturę białek na podstawie sekwencji aminokwasów. Trójwymiarowy widok białka włókna ogonowego pomógł zespołowi dowiedzieć się, jak je zmodyfikować, aby niezawodnie przylegało do ludzkich komórek.

W jednym z eksperymentów zespół był w stanie sprawić, by nanostrzykawki ze zmienionymi włóknami ogonowymi przylegały do receptora naskórkowego czynnika wzrostu (epidermal growth factor receptor, EGFR), który znajduje się na powierzchni niektórych ludzkich komórek nowotworowych. Załadowanie systemu iniekcyjnego toksyną zabiło prawie wszystkie komórki posiadające receptor, ale nie zaszkodziło innym komórkom, ilustrując jego specyficzność. Naukowcy dostosowali włókna ogonowe wstrzykiwaczy, aby rozpoznawały markery powierzchniowe również na innych typach komórek.

Zespół Zhanga odkrył również, że może załadować system różnymi ładunkami białkowymi, dodając do białek znacznik, który oznacza je jako amunicję, którą należy załadować na igłę strzykawki. Naukowcy dołączyli ten znacznik do toksyn białkowych i enzymu edytującego geny Cas9, dużych nożyczek molekularnych, które tną DNA w miejscu określonym przez cząsteczkę, która prowadzi nożyczki we właściwe miejsce. Gdy białka te zostały dostarczone do ludzkich komórek albo zabijały komórki, albo edytowały ich geny. „Udowodniliśmy, że poprzez umieszczenie znacznika na białku, możemy załadować różne rodzaje białek do igieł” - twierdzi Zhang. Możliwe jest również zwiększenie dawki, bo każda igła może również ładować wiele kopii białka, mówi Zhang.

Aby dalej badać tę technologię, naukowcy ponownie wykorzystali AlphaFold do zaprojektowania małych strzykawek, aby wiązały się z komórkami myszy i wstrzyknęli je do mózgu myszy, gdzie wprowadzili białko do neuronów, które sprawiło, że komórki świeciły. „Móc zrobić to wewnątrzczaszkowo u myszy i zobaczyć dostarczenie rzeczywistego ładunku do rzeczywistych neuronów - to niesamowite i imponujące” - mówi Rodolphe Barrangou, genetyk z North Carolina State University, który bada CRISPR-Cas, ale nie był zaangażowany w nowe badanie.

To jednak wciąż bardzo wczesny etap rozwoju tej technologii. Zhang planuje wykorzystać jej skuteczność jako urządzenia dostarczającego, a także eksperymentować z ładunkami niebiałkowymi, takimi jak DNA i RNA. W przyszłości ważne będzie przetestowanie technologii na „ssakach wyższych”, mówi Kay. „Istnieje wiele rzeczy, które działają dobrze u myszy lub mniejszych ssaków, a które nie działają tak dobrze u naczelnych lub ludzi” - dodaje. A ponieważ systemy iniekcyjne składają się z białek bakteryjnych, u ludzi mogą one również prowadzić do reakcji immunologicznych. „Musimy ustalić: Jak immunogenne będą, jeśli zaaplikujemy je ludziom?” mówi Zhang.

Jednakże praca ta pokazuje znaczenie inspiracji biologicznych w rozwiązywaniu trudnych problemów technicznych w biologii i medycynie, mówi Barrangou. „Jest to bardzo dobry przykład skupienia się na wydobywaniu z naturalnej biologicznej ciemnej materii interesujących elementów, które mają praktyczne zastosowanie i które są wystarczająco dobre, aby można je było wdrożyć” - mówi.